荧光寿命成像 (FLIM)在普通强度成像的基础上增加了一个时间维度,可以观察荧光衰减特性以及空间差别。FLIM可以分辨染色荧光蛋白(比如GFP与YFP)与自体荧光,并且不受荧光强度变化的影响。可以通过探测局部状况(诸如水浓度、pH值)来确定离子浓度(比如Ca2+),分辨DNA与RNA。
记录必要的时间相关的数据可以选择时间相关单光子计数(TCSPC)技术,该技术灵敏度高达单分子水平,可以探测皮秒时间精度。TCSPC只是与FLIM匹配的选择之一。可以结合单光子雪崩二极管(SPAD)与短脉冲激光器获得高灵敏度与高时间分辨率。FLIM的时间分辨性能通常用仪器响应函数(IRF)表示,IRF依赖于激光脉冲宽度、光子计数探测器的时间分辨率以及TCSPC的时间分辨率。其中最主要的是探测器,半导体激光器脉冲宽度可达100ps以下,TCSPC比如PicoHarp 300的时间分辨率小于12ps rms。美国Perkin Elmer 的SPCM-AQR型SPAD时间分辨率大于300ps,大大高于好的光电倍增管的时间分辨率,并且探测器脉冲的瞬时位置依赖于探测光子的总数(计数率),这对于FLIM测量很成问题。
现在意大利MPD公司的新一代PDM系列SPAD探测器克服了这个问题,其时间响应特性可与微通道板MCP相媲美,其IRF几乎与计数率无关,因此非常适合FLIM测量。
实验原理:
以下是雏菊花粉颗粒FLIM自体荧光成像的一个例子,皮秒半导体激光器发出的波长为532nm的激光束激发样品后,产生的荧光通过540nm—610nm的带通滤光片进行探测。使用时间分辨共焦荧光显微镜MicroTime 200进行测量,可以在单分子水平上进行荧光蛋白浓度的FLIM测量。使用两个不同的 SPAD探测器通道:MPD的探测直径范围为50um的PDM 50型SPAD以及Perkin Elmer 的探测直径范围为180um的 SPCM-AQR-14型SPAD。由PicoHarp 300 TCSPC模块进行记录成像,通过SymPhoTime软件来获得数据采集与分析。
测试结果与成像分析:
两个图比较明显的区别是:在0.6ns—1.4ns的范围内,用PDM SPAD探测器测量的荧光寿命图(左图)分布更均匀,右图对应高荧光密度的区域具有2.0ns的长荧光寿命。
对两图选定区域R1、R2进行放大后观察,用PDM SPAD探测器测量的R1 、R2区的颜色近似,表明荧光寿命近似,而用SPCM-AQR SPAD探测器测量的R2区荧光寿命比R1的大。不同花粉颗粒的类似部位,其荧光寿命应该类似,因此PDM SPAD探测器测量的荧光寿命更接近真实。这是因为PDM SPAD探测器的IRF几乎与计数率无关,因此非常适合FLIM测量。
使用尾部拟合后,R1、R2区荧光寿命差别变小。但是SPCM-AQR SPAD探测器测量的荧光寿命仍然偏大,这是因为SPCM-AQR SPAD探测器的时间分辨率较差。
讨论:
测量结果表明,尤其在高计数率时,新型PDM SPAD的时间特性(IRF宽度与波动)优于SPCM-AQR SPAD。高计数率对于快速FLIM成像非常重要,可以减少测量时间。同时,在中等计数率时,独立于计数率的稳定时间特性对于精密FLIM成像也是很重要的。
在快速FLIM成像中,很容易看出SPCM-AQR SPAD 的时间特性依赖于计数率,通过尾部拟合可以大大降低这种依赖性,但是,拟合过程需要更多的计算时间,并且由于SPCM-AQR SPAD时间分辨率低,总的荧光寿命会偏移变长。
结论:
上述结果表明PDM SPAD非常适合FLIM荧光寿命成像。PDM SPAD模块的响应时间为50ps FWHM,因此即使在荧光寿命很短时也可以用于时间分辨FRET(Forster共振能量转移)测量。PDM SPAD结合了优异的时间分辨特性以及在550nm处高达48%的高探测效率(与SPCM-AQR SPAD近似),可以用在单分子技术中,比如FCS荧光关联能谱研究。